Ezio Auditore continúa en PS3 las aventuras que concluyó en Assassin's Creed 2, pero esta vez en Roma, el último reducto de los Templarios en la Italia Renacentista. Tendremos que acudir a la Ciudad Eterna y conquistar poco a poco sus zonas, rehabilitándolas y convirtiéndolas en territorio de los asesinos. También tendremos que cumplir misiones de asesinato para acabar con los secuaces de los Borgia, hasta enfrentarnos a nuestro peor enemigo, César Borgia. Para ello contaremos con la ayuda de Leonardo Da Vinci y Maquiavelo, entre otros, y con un grupo de asesinos, nuestra Hermandad, que nos ayudarán en las misiones.